Transfektion
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Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA in Zellkulturzellen. Dabei unterscheidet man zwischen dem nur zeitweiligen Einbringen des Plasmids in die Wirtszelle (transiente Transfektion) und dem dauerhaften Einbau in das Genom (stabile Transfektion). Durch Abbauprozesse wird fremde DNA normalerweise schnell abgebaut, nach dem Einbau in die Wirts-DNA wird dieser Vorgang jedoch unterbunden.
Je nach Zellart eignen sich verschiedene Verfahren.
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Chemische Verfahren
Im Prinzip handelt es sich hierbei um einen Spezialfall der Transformation, die jedoch als Methode eher in der Mikrobiologie Verwendung findet.
Calcium-Phosphat-Präzipitation
Das am häufigsten verwendete Transfektionsverfahren. In einem Gemisch aus Calciumchlorid und Natriumphosphat bindet sich die zu übertragende DNA an ausfallendes Calciumphosphat. Die ausgefallenen Kristalle werden der Zellkultur zugegeben und von den Zellen durch Endocytose aufgenommen. Der ganze Vorgang ist stark abhängig von der Wahl der richtigen Salzkonzentrationen und erfordert von Zellart zu Zellart experimentelles Geschick und Erfahrung.
Physikalische Verfahren
Mikroinjektion
Ein technisch sehr aufwändiges Verfahren, bei dem die DNA (Plasmid, ssDNA, dsDNA) mit einer Injektionsapperatur direkt in den Zellkern bzw. in die Zelle injiziert wird. Dieses Verfahren ist sehr erfolgsversprechend, allerdings können immer nur wenige Zellen untersucht werden.
Schockgefrieren mit Glycerin
Die zu behandelnden Zellen werden bei -70°C schockgefroren und so für die DNA-Aufnahme "kompetent" gemacht.
Elektroporation
Hierbei wird die Zellmembran durch Elektroschocks für DNA permeabel gemacht. Dieses Verfahren eignet sich nur für einige Zelltypen, da es bei diesem Verfahren zu Schäden innerhalb der Zelle kommen kann.
Zum Mechanismus: Da die Zellmembran eine Isolierung des elektrisch leitfähigen Cytoplasmas darstellt, kann elektrischer Strom so lange nicht durch die Zelle fließen, bis Poren in der Membran entstanden sind. Wird nun eine elektrische Spannung angelegt, so kommt es zur Polarisierung der Membran. Erreicht die transmembrane Spannung einen kritischen Wert von 0,4 bis 1 V, so kommt es durch eine lokale Zerstörung der Membranintegrität spontan zur drastischen Erhöhung ihrer Leitfähigkeit. Primär in der Membran entstandene hydrophoben Poren verwandeln sich bei Erreichen eines kritischen Radius spontan in relativ stabile hydrophile Poren (0,5-1 nm) mit einer Lebensdauer von wenigen Sekunden bis einigen Minuten. (nach Sukharev 1994)
"Particle Gun"
Bei diesem Verfahren wird die Fremd-DNA mit Hilfe von winzigen Metallkügelchen, auf denen die DNA fixiert wurde, in die Zelle geschossen.
