HPLC
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HPLC steht für High Performance Liquid Chromatography (in den Anfangszeiten dieser Technik auch für High Pressure Liquid Chromatography). Das deutsche Wort Hochleistungs-Flüssigchromatographie wird nur sehr selten verwendet.
Funktionsweise
Es handelt sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem die zu untersuchende Substanz zusammen mit einem flüssigen Laufmittel, der "mobilen Phase" (auch "Eluent" genannt) durch eine so genannte Trennsäule, die die "stationäre Phase" enthält, mithilfe von Pumpen gedrückt wird. Üblicherweise geht der Trennsäule eine Vorsäule vorher, die wesentlich billiger als die Trennsäule ist und zur Abhaltung von Verunreinigungen dient, eine Trennsäule in einem HPLC-Gerät ist zwischen 5 und 30cm lang.
Wechselwirkt ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären Phase, verbleibt er relativ lange in der Säule. Wechselwirkt er hingegen schwach mit der stationären Phase, verlässt er die Säule früher. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Bestandteile der Substanz zu verschiedenen Zeiten (den "Retentionszeiten") am Ende der Trennsäule, wo sie dann mit einem geeigneten Detektor nachgewiesen werden können.
Es werden zwei Methoden unterschieden: Normal Phase (NP) und Reversed Phase (RP). Bei der NP-HPLC wird eine polare stationäre Phase (z.B. Silikagele/Kieselgel) genutzt. Die Stärke der Elutionskraft der mobilen Phase ist im allgemeinen abhängig von der Polarität. Die verschiedenen Lösungsmittel sind nach steigender Polarität in der eluotropen Reihe angeordnet. Je polarer eine mobile Phase ist, desto schneller wird eine Substanz eluiert. Polare Moleküle werden auf der Säule länger retardiert (zurückgehalten) als unpolare Moleküle und verlassen deshalb später die Säule.
Die RP-HPLC ist in der Praxis die gängigste Methode. 70% aller analytischen HPLC-Trennungen sind RP-Trennungen. Hier wird eine unpolare stationäre Phase verwendet und die Elutionskraft sinkt mit steigender Polarität. Die stationäre Phase wird hergestellt, indem man Silane welche mit langkettigen Kohlenwasserstoffen substituiert wurden, mit Silicagel reagieren läßt. Dabei wird die polare Oberfläche der Silicagel-Partikel mir einer unpolaren Schicht aus Alkanen überzogen, also die Polarität umgekehrt (engl.: "reversed") . Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer und Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF) oder Methanol eingesetzt. Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung der Mobilen Phase während der gesamten Zeit gleich. Bei Gradiententrennungen wird die Polarität des Fließmittelgemisches während der Analyse verändert.
Besondere Anwendung findet die RP-HPLC bei der Auftrennung von polaren Analyten die auf Normalphasen zu hohe Retentionszeiten aufweisen würden. Dafür wird meist eine C18-Säule (also ein Octadecylsilan als Derivatisierungsreagenz für das Silicagel) eingesetzt, die Detektion erfolgt zumeist mittels UV- oder Fluoreszenzdetektor.
Detektoren
Je länger die vorhergehende Säule mit ihren Phasen ist, desto höher ist die Auflösung der Detektoren
- Lichtstreudetektor
- Fluoreszenzdetektor, dabei wird der Detektor im 90° Winkel zur Lichtquelle positioniert. Das emitierte Licht ist die Fluoreszenz. Der Vorteil genüber dem UV-Detektor ist die etwa tausendfach erhöhte Empfindlichkeit.
- Brechungsindexdetektor
- Massenspektrometer
- Leitfähigkeitsdetektor
- Elektrochemischer Detektor
Bsp
siehe auch Chromatografie oder Anionenaustauschchromatografie
